产品货号：
YTB4100
中文名称：
Bst6.0 DNA聚合酶
英文名称：
Bst6.0 DNA Polymerase
产品规格：
8kU|40kU
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是Bst DNA聚合酶，大片段(货号：YTB4033)的一种同源蛋白，即嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段的同源蛋白，和Bst DNA聚合酶大片段相比，具有更强的5'→3'DNA聚合酶活性、更强的链置换能力、dUTP耐受性、耐盐性以及非离子去垢剂耐受性。Bst6.0 DNA聚合酶不具有5'→3'和3'→5'的核酸外切酶活性，可应用于环介导的等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增技术(CPA)、滚环扩增(RCA)和基于滚环扩增的等温扩增反应等。Bst6.0 DNA聚合酶介导的等温扩增温度一般在50～68℃之间，通常为65℃，最佳温度与所使用的引物和扩增的产物有关，需要通过实验进行优化。
环介导等温扩增LAMP、交叉引物扩增技术(CPA)、滚环扩增(RCA)和解旋酶等温扩增(HDA)等DNA等温扩增，多重置换扩增(MDA)，链置换DNA合成，全基因组扩增(WGA)，高GC含量的DNA的测序，纳克级DNA模板的快速测序，建库测序等。
一个活性单位是指65℃，30分钟内将10nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量。
Bst6.0 DNA聚合酶通过大肠杆菌重组表达和纯化而获得。
| 组分 | 8kU | 40kU |
| Bst6.0 DNA聚合酶(40U/μL) | 200μL | 1mL |
| 10×Bst6.0 Reaction Buffer | 600μL | 3mL |
| 100mM MgSO4 | 400μL | 2mL |
保存：-20℃，有效期2年。
10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1% Triton X-100，50% Glycerol (pH7.5@25℃)。
10×Bst6.0 Reaction Buffer：
200mM Tris-HCl，500mM KCl，100mM (NH4)2S04，20mM MgS04，1%Tween-20 (pH8.8@25℃)。
无DNA内切酶和外切酶活性。
80℃加热20分钟可使Bst 6.0 DNA Polymerase失活。
- Bst6.0 DNA聚合酶不具有5'→3'的核酸外切酶活性。
- 建议等温扩增反应温度不能高于70℃，否则会导致酶失活。
- Bst6.0 DNA聚合酶不能用于热循环测序或PCR。
- 每次等温扩增实验建议设置仅无模板DNA的阴性对照，以排除背景性扩增。
- Bst6.0 DNA聚合酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
- 引物设计。
环介导的等温扩增引物的设计可以参考http://primerexplorer.jp/e/，建议使用V5版本。具体操作手册可以在http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html下载。环介导等温扩增引物的初步筛选可参照该操作手册，具体需要通过实验来验证比较合适的引物。LAMP引物由4个或6个(含Loop)引物组成，建议加入Loop环引物设计，即设计6条引物进行实验。 - 以LAMP等温扩增为例，参考下表设置反应体系。
成分 用量 终浓度 无菌无酶超纯水(货号：YT998) (15.6-x)μL - 10×Bst6.0 Reaction Buffer 2.5μL 1× 100mM MgSO4 1.5μL 6mM(8mM total) dNTP混合液(各25mM，货号：YTB4052) 1.4μL 各1.4mM FIP/BIP Primers (25×,40μM) 1μL 1.6μM F3/B3 Primers (25×,5μM) 1μL 0.2μM Loop F/B Primers (25×,10μM) 1μL 0.4μM 模板 xμl ≥10copies Bst6.0 DNA聚合酶(40U/μL) 1μL 1600U/mL 总体积 25μL - - 在配制反应体系完成后，可每25μL体系的反应管管盖加适量高浓度的SYBR Green I 1μL，待等温扩增反应结束后，8000×g离心1分钟，反应体系变荧光绿为阳性，保持无色或棕色为阴性。也可以无需添加指示剂，待反应程序结束后，可见反应液明显变浑浊为阳性，反应液保持透明为阴性。
- 如需优化反应，可调整Mg2+浓度(4～10mM)，酶量(0.04～0.32U/μl)或改变反应温度(50～68℃)。
- 如果通过琼脂糖凝胶电泳或其它需要打开LAMP反应容器的方法进行分析，请设置辅助分析区域和设备，以避免污染。
- 由于反应比较迅速，为了确保实验的重现性，建议模板DNA最后加入。
- 强烈建议设置未加模板的阴性对照，以确保扩增的特异性。
- 为了防止在配制试剂时发生污染，请务必在超净工作台内进行操作。
- 试剂及模板DNA的配制操作尽量需要和PCR产物的电泳等分析在不同的区域进行，以免发生污染。
- 在配制反应体系完成后，可每25μL体系的反应管管盖加适量高浓度的SYBR Green I 1μL，待等温扩增反应结束后，8000×g离心1分钟，反应体系变荧光绿为阳性，保持无色或棕色为阴性。也可以无需添加指示剂，待反应程序结束后，可见反应液明显变浑浊为阳性，反应液保持透明为阴性。
- 反应程序：65℃温育60分钟。
- 灭活：80℃加热20分钟。
- 如实验需要，可以用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳图显示扩增产物为梯度条带为阳性，无梯度条带为阴性。
- Bst6.0 DNA聚合酶活性效果参考图1。
图1．Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用不同量的百奥莱博的本制品或N公司的Bst 2.0 DNA polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，在1×Bst6.0 Reaction Buffer(2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，65℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有相当的酶活性效果。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。 - Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应可耐受高浓度的dUTP参考图2。
图2．Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的高dUTP耐受性的效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用不同量的本制品或N公司的Bst 2.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，1.4mM dUTP，0.04U UDG酶(货号：YTB4034)，在1×Bst 6.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，65℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的高dUTP耐受性。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。 - Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应可耐受高浓度的非离子去垢剂参考图3。
图3．Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的高非离子去垢剂耐受性的效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用相同量的本制品或N公司的Bst 2.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，5%非离子去垢剂（A,Tween-20;B,NP-40;C,TritonX-100），在1×Bst 6.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，65℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似对非离子洗涤剂的高耐受性。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。 - Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应可耐受高浓度的钾离子(K+)参考图4。
图4．Bst6.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的耐盐性(K+)效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用不同量的本制品或N公司的Bst 2.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，在1×Bst6.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，同时补加KCl至终浓度为10mM、50mM或100mM，65℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的耐盐性(K+)。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
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